01. BALF结核分枝杆菌病原学检查:胸内结节病主要与涂阴肺结核进行鉴别，该类患者临床以干咳少痰为主，痰结核分枝杆菌病原学检查阳性率较低。BALF结核分枝杆菌检查可以为结核病诊断提供重要的线索和依据。对BALF行GeneXpert MTB/RIF检查为痰涂片阴性或痰液样本不足的患者提供了一个可靠的替代方法。国内一项横断面研究表明，BALF的GeneXpert MTB/RIF、宏基因组二代测序(metagenomics next-generation sequencing, mNGS)、结核分枝杆菌培养诊断肺结核的敏感度分别为69.0%、59.9%、59.9%，远高于BALF涂片法（24.6%）。其中，GeneXpert MTB/RIF敏感度最高，mNGS还可同时检测NTM和其他致病菌，可以根据诊断需求选择应用。总之，在结节病与结核病鉴别时，推荐开展BALF结核分枝杆菌分子生物学检查或培养，优化BALF在两病鉴别中的应用。

02. BALF细胞学与T细胞亚群分析：BALF有核细胞分类和淋巴细胞亚群对于结节病的诊断及活动性的判断具有参考价值。肺结节病BALF淋巴细胞百分比一般大于15%，CD4+/CD8+T细胞比值（>3.5）诊断结节病的敏感度为53%，特异度为94%。多项研究表明，肺结核BALF的CD4+/CD8+T细胞比值升高，平均值在1.23~2.9之间，略低于结节病组。据文献报道，21%~29%的肺结核患者BALF的CD4+/CD8+T细胞比值大于3.5，但研究均未对入选肺结核患者的临床表现和影像学类型进行阐述。结合上述结果，目前仍认为CD4+/CD8+T细胞比值对于结节病和结核病鉴别具有参考价值，但应尽量避免仅凭CD4+/CD8+T细胞比值诊断或除外结节病，诊断仍需结合临床。

肉芽肿病变内找到结核分枝杆菌是确诊结核病的强有力证据。在我国结核病流行背景下，对病理查见的肉芽肿病变建议常规进行特殊染色（包括但不限于抗酸染色）并报告结果。结核分枝杆菌需在高倍镜或油镜下仔细寻找，多在坏死与存活组织交界处，也可在坏死中心或者细胞肉芽肿内查见，有条件可以加做结核分枝杆菌及真菌的荧光染色。病理组织切片抗酸染色技术操作简便，但阳性率较低，仅达15.5%~29%。因此，抗酸染色阴性仍不能排除结核病。另外，由于抗酸染色法难以区分结核分枝杆菌和NTM，应通过对硝基苯甲酸(PNB) 选择性培养基法、MPT64抗原检测法或核酸扩增实验完成初步菌种鉴定。

在怀疑结核病时，临床医师对获得的活检或手术标本应及时送组织培养。组织培养可以检测出具有生长活性的分枝杆菌，可以通过菌种鉴定鉴别结核分枝杆菌及NTM，并可完成药物敏感性试验。结核病病理组织标本中结核分枝杆菌培养的阳性率为30%~73%，明显高于抗酸染色。分枝杆菌培养包括固体培养和液体培养两种方法。液体分枝杆菌培养管(MGIT) 方法显示出比固体培养更高的阳性率。固体培养基方法约4周报告阳性结果，阴性结果通常需要8周；液体培养技术（如全自动快速分枝杆菌培养系统）一般2~3周报阳性结果，阴性结果一般为6周。需要指出的是，分枝杆菌培养耗时较长，难以满足临床即时诊断需求，是其主要不足。

在结核病与结节病的组织病理学鉴别中，应综合评价组织形态学和病原学检测结果。对具备结核分枝杆菌感染对应的组织形态学表现，同时，组织培养阳性并经菌种鉴定为结核分枝杆菌可确定结核病；具备结核分枝杆菌感染对应的组织形态学表现，但抗酸染色及组织培养阴性，应进一步结合临床表现及影像学特征，必要时进行组织标本DNA检测；具备结节病的典型组织形态学表现，同时，组织培养阴性，临床表现及胸部CT影像特征符合结节病，可做出结节病诊断。如缺乏组织学或病原学证据，或二者不一致，推荐多学科联合会诊(multi-disciplinary team, MDT)。

近年来，各种结核分枝杆菌分子生物学诊断技术在结核病与结节病的诊断与鉴别诊断中得到应用，如原位杂交、实时荧光定量PCR、线性探针和宏基因组测序技术等。原位杂交技术属于非扩增探针技术，对组织量要求低，可在组织切片上完成检测，但敏感度较低。PCR技术具有快速、敏感度和特异度高的优点。其中，GeneXpert MTB/RIF用于快速诊断结核病得到了WHO建议，推荐其作为显微镜检查、培养或组织病理学的替代性诊断，可用于检测非呼吸道标本（淋巴结和其他组织）。研究表明，EBUS-TBNA活检标本GeneXpert MTB/RIF诊断结核病的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值分别为49.1%、97.9%、92.9%和77.3%。

分子生物学检测方法提高了结核分枝杆菌DNA检测阳性率，但同时也增加了诊断困惑。Gupta等通过荟萃分析，对874例证实为结节病的组织学样本（主要为淋巴结组织）使用PCR法进行核酸扩增并鉴定了不同类型分枝杆菌特异性的核酸序列，发现26.4%（231份标本）结节病样本呈分枝杆菌阳性，其中，81.0%（187份标本）为结核分枝杆菌DNA检测阳性。国内报道结节病活检标本的结核分枝杆菌DNA阳性率为19.2%，与之接近。由于传统的培养技术很难在结节病组织中分离出结核分枝杆菌，二者的关联性至今仍无定论。有研究推测，一些特异性的、降解不良的分枝杆菌抗原导致了免疫介导的肉芽肿性炎症，而不是完整的具有活性的分枝杆菌导致结节病。在临床实践中，组织学标本结核分枝杆菌DNA阳性与临床表现不符的情况并不少见，分析存在几种可能的原因：（1）提示为LTBI或结核病亚临床状态；（2）陈旧病变残留结核分枝杆菌死菌或难以降解的抗原片段；（3）因实验室污染（包括石蜡包埋标本的污染等）造成的假阳性等。因此，对于组织标本结核分枝杆菌DNA阳性并非现症感染确切依据的情况，应审慎对待。我国为结核高感染国家，结核感染导致的肺内陈旧性病变和淋巴结病变较为多见，自愈后结核分枝杆菌死菌片段残留在淋巴结或肺组织中可能是造成其DNA阳性的主要原因。鉴于人群的结核高感染环境，应遵循不但要在病变组织中分离培养出活性纯系菌株，而且该菌株接种到动物可致病，方可确认致病病原体的科赫法则，强调分枝杆菌培养仍是结核病诊断的金标准。分子生物学检测技术诊断快速，可以满足即时诊断需求，在传统病原学检查阴性的情况下可以发挥补充证据作用，而不能过度依赖，此与结核病低流行国家和地区情况存在不同。另外，需与结核病鉴别时，应送检新鲜的活检或手术组织标本供分子生物学检测。

最近，有研究针对EBUS-TBNA标本使用结核分枝杆菌RNA恒温扩增实时荧光检测(simultaneous amplification and testing method for Mycobacterium tuberculosis RNA, SAT-TB),该技术可以鉴别死菌与活菌，可有效将结节病组织标本中死菌片段造成的PCR假阳性剔除。SAT-TB在区分涂阴肺结核与结节病方面的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和诊断准确率分别为77.8%、100.0%、100.0%、93.1%和94.4%。由于rRNA极易降解，其对标本要求相对较高，该技术尚未推广应用评价；还有研究通过对测序原始序列中的低质量序列和导管接头污染进行了去除和过滤，重新制定了NGS测序数据分析标准（深度>10倍和覆盖率>15%），分别对44例结核病和47例结节病患者的活检组织标本进行结核分枝杆菌检测，改良NGS识别结核病的敏感度和特异度分别达到81.8%和95.7%，对快速区分结核病和结节病可能具有价值。